توسعه یک ماده ضد پیری طبیعی بر اساس Quercus pubescens Willd. عصاره برگ - یک مطالعه موردی
چکیده:
مصرف کنندگان نه تنها به جنبه های ایمنی و بهداشتی عناصر وارد فرمولاسیون مواد آرایشی آنها بلکه به قدرت ، منشاء ، فرآوری ، ارزش اخلاقی و رد پای محیط توجه بیشتری می کنند. پایداری زنجیره تأمین ، حفظ تنوع زیستی و همچنین تکنیکهای استخراج سبز از این رو در بین مصرف کنندگان بسیار محبوب است. مصرف کنندگان در درجه اول نگران اثر محصولات آرایشی و بهداشتی مورد استفاده خود هستند و برچسب های محصول را بطور مداوم مورد بررسی قرار می دهند ، بنابراین استدلال های بازاریابی برای حمایت از ادعاها (ضد پیری ، ضد آلودگی و غیره) باید براساس آزمایشات دقیق و نتایج قابل اعتماد باشد. بسته بندی محصول در نتیجه ، افزایش تقاضا برای مواد طبیعی با فعالیتهای زیستی ارزیابی شده ، استراتژیهای اتخاذ شده توسط متخصصان آرایشی و بهداشتی را به شدت برای نوآوری از نظر فعال اصلاح کرده است. ترشح و تولید مواد طبیعی آرایشی طبیعی جدید یک روش طولانی مدت است که در مقاله حاضر کاملاً شرح داده شده است ، از طریق نمونه طراحی هر دو ماده مایع و جامد بر اساس Quercus pubescens Willd. عصاره برگ ، که برای آن خواص ضد پیری با ترکیبی از روشهای آزمایشگاهی ارزیابی شد.
کلید واژه ها:
مواد آرایشی طبیعی؛ Quercus pubescens Willd .؛ بلوط ترافل؛ ضد پیری؛ سنجشهای زیبایی؛ فلاونوئیدها ترکیبات فنلی
1. معرفی
به طور مداوم در حال تحول در سبک زندگی مصرف کنندگان محرک اصلی تحول صنعت لوازم آرایشی و بهداشتی در سراسر جهان است که در طی دو دهه گذشته انجام می شود [1]: پیش بینی می شود این بخش تا سال 2022 به 429.8 میلیارد دلار برسد و CAGR 4.3٪ را ثبت کند (نرخ رشد سالانه مرکب ، دوره پیش بینی 2016-2022) [2]. تمایل به زیبایی طبیعی و محصولات مراقبت شخصی از چند سال پیش آغاز شده است که به دلیل ملاحظات زیست محیطی و اخلاقی مصرف کنندگان و خواست آنها برای آرایشی و بهداشتی ایمن تر شده است. "طبیعی" اغلب ، نه همیشه کاملاً صحیح ، مترادف "محصولات ایمن تر که عوارض جانبی کمتری را در ذهن مصرف کنندگان دارند" وجود دارد و یکی از آنها به شکلی از شکوفایی ادعاهای "بدون" توجه می کند. به طور خلاصه ، مصرف کنندگان به دنبال مواد آرایشی ایمن تر و سبز تر هستند و حق بیمه واقعی را در اختیار آنها قرار می دهند ، بنابراین تولید کنندگان باید مدارکی ملموس از ادعاهای ادعا شده در بسته بندی محصولات ارائه دهند [3،4]. در نتیجه ، تولید کنندگان دائماً به دنبال اصالت و طبیعی بودن هستند ، در حالی که چندین برابر سنجی برای اثبات علمی ادعاهای آرایشی [5] ، و بازار زیبایی های طبیعی با ارزش تقریبی 11.06 میلیارد دلار در سراسر جهان در سال 2016 ارزش دارد ، تخمین زده می شود که در سال 2024 تقریبا به 22 میلیارد دلار آمریکا برسد [6 ]
انتظار می رود که بازار جهانی مواد آرایشی در سال 2016 حدود 22.9 میلیارد دلار آمریکا در سال 2016 افزایش یابد و تا پایان سال 2025 به 33.80 میلیارد دلار برسد [7،8]. حتی در حال پیشرفت مداوم ، مواد طبیعی هنوز هم امروز تنها 7٪ از بازار جهانی را نشان می دهند [9]. برای پیگیری روندهای فعلی ، تولید کنندگان لوازم آرایشی باید با بی وقفه نوآوری و تولید مواد طبیعی جدید مطابق با ترجیحات مصرف کننده ، با استفاده از آخرین فن آوری های استخراج و به ویژه اکو استخراج (روش های فعال سازی مانند سونوگرافی یا مایکروویو ، حلال های سبز و غیره) را نوآوری و توسعه دهند. [10]) ، یا
کاوش در پتانسیل منابع طبیعی اولیه ، ضمن حفظ پایداری و اخلاق. تولیدکنندگان می توانند یکی از دو استراتژی زیر را برای تأمین منابع طبیعی مواد معدنی اتخاذ کنند: آنها یا می توانند دانش اتنوبوتانیک را فراخوانی کنند ، یعنی گیاهان مورد علاقه خود را بر اساس استفاده سنتی مشهور خود انتخاب کنند (این کشف مجدد گیاهان سنتی بخصوص در مناطقی که چنین ارائه می دهند کارآمد است. روشهای مداوم یا مبتنی بر یک غربالگری با توان بالا (که اغلب در مناطق صنعتی تر ترجیح داده می شوند ، جایی که تمایلات سنتی از بین می رود) [11].
مصرف کنندگان روزانه در معرض آلاینده های هوا (ترکیبات آلی فرار ، ازن ، ذرات و غیره) و در اختیار انواع منابع نور آبی (فلورسنت و LED قرار می گیرند ، تلویزیون صفحه تخت ، دستگاه های دیجیتالی مانند تلفن های هوشمند ، لپ تاپ و غیره) . آنها بیشتر و بیشتر با تأثیر آلودگی و سبک زندگی پرحرارت ، بر کیفیت و زیبایی پوست خود نگران هستند [12،13]. این دغدغه ها به شدت دستورالعمل های بازار لوازم آرایشی را در طی چند سال آینده تعیین می کند: ضد آلودگی ، ضد آبی و علاوه بر این ، ضد پیری باعث افزایش صدای بازار لوازم آرایشی خواهد شد. سلامت و زیبایی پوست از نزدیک با رفاه عمومی مصرف کنندگان در ارتباط است ، بنابراین جای تعجب ندارد که لوازم آرایشی و بهداشتی بخش زیبایی را تشکیل می دهد که شاهد رشد شدیدترین دوره در طی دوره 1998–2010 هستیم ، با این که سهام ماکت از 16.4 to به 23.0 ol در حال تکامل است. 1] پیری پوست یک فرآیند بیولوژیکی پیچیده است که تحت تأثیر ترکیبی از عوامل درون زا (ژنتیک ، فرآیندهای متابولیک و غیره) و برون زا (آلودگی ، اشعه ماوراء بنفش ، مواد شیمیایی و غیره) قرار دارد [14،15]. برای مقابله با علائم قابل مشاهده سالخوردگی ، مواد آرایشی ضد پیری باعث تقویت سدیم پوست ، بهبود خاصیت ارتجاعی پوست ، تقویت چگالی آن ، محافظت از آن در برابر رادیکال ها ، چروک های محو شده ، کاهش ظهور لکه های سنی و غیره می شود و به دنبال زیبایی و واقعیت های جمعیت شناختی - امید به زندگی در طی چند سال اخیر سریعترین سود خود را که از دهه 1960 به ثبت رسیده است [16] - تقاضا برای داروهای ضد پیری و فرمولاسیون را بطور قابل ملاحظه ای و بی وقفه تحریک می کند. این بخش نیز از این قاعده مستثنا نیست: قوانین طبیعی بودن.
تنوع زیستی در سراسر جهان مخزن استثنایی از مولکول های نوآورانه است که ساختارها و عملکردهای بسیار متنوعی را نشان می دهد که می تواند برای انواع داروهای جدید و همچنین توسعه زیبایی مورد استفاده قرار گیرد. منطقه مدیترانه از دیرباز بعنوان منطقه ای که دارای تنوع زیستی بالایی است به دلیل داشتن فلور قابل توجه و به ویژه میزان بالای گونه های بومی خود: به عنوان تنها 2٪ سطح جهان را نشان می دهد ، این منطقه 20٪ از کل غنای فلوریستی جهان را در خود جای داده است [18 ، 19]. این بیوم مدیترانه ای از این رو یک هدف انتخابی برای منبع مولکول های جالب و به ویژه مواد طبیعی در نظر گرفته شده برای مواد آرایشی و فرمولاسیون مراقبت های شخصی را تشکیل می دهد. تیم تحقیقاتی ما به دلیل استقرار در قلب این منطقه ثروتمند و داشتن تخصص در فیتوشیمی ، به این تنوع از طریق همکاری های دیرینه دسترسی دارد. از این رو ، 50 گیاه مدیترانه ای بر اساس میزان دسترسی و اصالت آنها در مورد فعالیت ضد پیری (بدون قدمتی مانند مقاله علمی یا حق ثبت اختراع موجود) در آزمایشگاه برای مطالعه حاضر انتخاب شدند. از این رو ، عصاره های حلال آبی و آلی و همچنین اسانس ها به دلیل خاصیت ضد پیری آنها مورد بررسی قرار گرفت. از این بررسی ، عصاره خام Quercus pubescens Willd. (Fagaceae) برگها بهترین فعالیتهای ضد پیری را نشان می دهد و پس از آن برای تحقیقات بیشتر منجر به ایجاد یک فعال ضد پیری فعال و فرمولاسیون زیبایی آن می شود.
خرید محصولات آرایشی از فروشگاه لیدی مد
Q. pubescens (جنس Quercus فرقه. Quercus) ، که معمولاً به عنوان بلوط زیر آب یا بلوغ شناخته می شود ، گونه ای از بلوط سفید بومی در جنوب اروپا و جنوب غربی آسیا است [20]؛ کلمه "pubescens" به معنای "با برس نرم" در واقع به برگها و شاخه های مودار آن اشاره دارد و سازگاری با خشکسالی است. این گونه همچنین به عنوان "بلوط ترافل" شناخته می شود زیرا در بین سایر گونه ها به عنوان میزبان ترافلهای مهم اقتصادی نیز خدمت می کند. Q. pubescens یک درخت برگریز با اندازه متوسط است که تا 20 متر رشد می کند ، به طور ترجیحی در مناطقی که دارای یک میکروقلایمر زیر مدیترانه ای هستند که با تابستانهای خشک و گرم و زمستانهای خنک و با بارندگی کمی همراه است [21،22]. به ویژه سازگار ، این گونه در خاکهای آهک خوب زهکشی و همچنین در زمینه های اسیدی رشد می کند و از سطح دریا تا 1300 متر یافت می شود [23]. عصاره گونه های مختلف بلوط قبلاً در مواد آرایشی مورد استفاده قرار می گیرد ، به طور عمده به عنوان داروهای تهویه پوست. با این حال ، این مواد اکثراً بر پایه عصاره چوب یا پوست صورت می گیرند: چنین نمونه گیری بقای درختان بلوط را به خطر می اندازد و بنابراین پایدار نیست [24،25،26،27]. یکی از اختراعات ثبت شده ، ترکیب یک فرمول آرایشی و بهداشتی آنتی اکسیدان را براساس عصاره های پوست Q. robur ، Q. ilex و Q. pubescens نشان می دهد [28]. به دانش ما ، هیچ مطالعه قبلی از توسعه و استفاده بعدی از عصاره برگ Q. pubescens به عنوان یک ماده آرایشی و بهداشتی خبر نمی دهد.
ساختن و عینیت بخشیدن به مواد جدید آرایشی طبیعی روشی طولانی مدت است که در این مقاله به تفصیل ارائه می شود ، از طریق نمونه طراحی یک ماده ضد پیری براساس عصاره برگ Q. pubescens. مرحله اول شامل بهینه سازی روش استخراج برگهای Q. pubescens برای پتانسیل تجمع بیولوژیکی عصاره حاصل و در عین حال در خاطر داشتن مقیاس صنعتی بیشتر آن است. بخش دوم از چنین پیشرفتی شامل بهبود فرمولاسیون عصاره ، از جمله تغییر رنگ و یا دفع آن ، و توسعه بیشتر هر دو شکل مایع و جامد از ماده آرایشی است.
2. مواد و روش ها
تمام مواد شیمیایی از سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس ، MO ، ایالات متحده) به دست آمد ، مگر اینکه در موارد دیگری بیان شده باشد.
2.1. ماده ی گیاهی
برگهای Q. pubescens به ترتیب در دسامبر سال 2016 و در ژوئن سال 2017 از دو مکان مختلف در Provence-Alpes-Côte d’Azur ، فرانسه جمع آوری شد (شکل 1): Vinon-sur-Verdon و پارک Valrose در Nice. یک کوپن در مجموعه گیاه شناسی در موزه تاریخ طبیعی نیس با شماره مرجع NICE-D-4382 سپرده شده است.

شکل 1. کروماتوگرام HPLC به دست آمده در یک ستون Luna® C18 (150 میلی متر mm 4.6 میلی متر ؛ 5 میکرومتر) در 330 نانومتر و با ELSD ، خانواده های اصلی ترکیبات مشخص شده در عصاره Oak1 را نشان می دهد.
خرید محصولات آرایشی از فروشگاه لیدی مد
2.2. استخراج گیاه
مواد گیاهی هوا خشک شده و خرد شده در پودر ریز خرد شده است. استخراج مواد گیاهی سپس با استفاده از سیستم آب یا اتانول (H2O / EtOH 1/1) یا EtOH خالص انجام شد. حدود 1 گرم ماده گیاهی با تقریبا 10 گرم حلال (نسبت استخراج 1/10) در دمای اتاق (RT) با استفاده از همزن مغناطیسی (500 دور در دقیقه) به مدت 2 ساعت استخراج شد. عصاره های بدست آمده سپس بر روی کاغذ فیلتر 8–12 میکرومتر فیلتر شدند ، جمع شدند و خلاء غلیظ تا خشکی شدند.
2.3 کسری عصاره برگ Q. pubescens
برای شناسایی کسری فعال ، عصاره H2O / EtOH 1/1 برگ Q. pubescens سپس بر روی ژل سیلیکا (فاز طبیعی) تکه تکه شد. کسری عصاره فله منجر به بهبود 5 کسری مجزا شد: F1 (250 میلی لیتر سیکلوهگزان) ، F2 (250 میلی لیتر سیکلوهگزان / دی اتیل اتر 1/1) ، F3 (250 میلی لیتر دی اتیل اتر) ، F4 (250 میلی لیتر متانول) و F5 (250 میلی لیتر متانول / آب 1/1). کسرهای حاصل بیشتر به دلیل زیست فعال بودن آنها مورد بررسی قرار گرفت و ترکیبات مربوط به آنها توسط HPLC (کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا) و GC (کروماتوگرافی گازی) ، و همچنین توسط UPLC-HRMS (کروماتوگرافی مایع فوق العاده با کارایی بالا-طیف سنجی جرمی با وضوح بالا) مورد بررسی قرار گرفت. در شرایط ارائه شده در بخش های بعدی)
2.4 کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
2.4.1. تجزیه و تحلیل HPLC
عصاره ها و فراکسیون های خام رقیق شده با 10 میلی گرم در میلی لیتر در متانول (MeOH ؛ درجه کروماتوگرافی) و بیش از 0.45 میکرومتر فیلتر سرنگ PTFE (polytetrafluoroethylene) تصفیه شده ، با استفاده از یک سیستم HPLC Agilent 1200 (Courtaboeuf ، Ile-de-France، France) مجهز شدند. با یک DAD (دیود آرایه ردیاب) و یک ELSD (آشکارساز پراکندگی نور تبخیر) که تحت شرایط زیر کار می کند: حجم تزریق: 20 میکرولیتر و سرعت جریان: 1.0 میلی لیتر در دقیقه. جداسازی بر روی یک ستون C18 انجام شد (Phenomenex، Le Pecq، Ile-de-France، France؛ Luna® 5 میکرومتر ، 150 میلی متر × 4.6 میلی متر از من). مرحله تلفن همراه شامل یک شیب چند مرحله ای از آب (A) ، استونیتریل (B) و 2-پروپانول (C) ، همه با 0.1 acid اسید فرمیک اسیدی شد: 5-5 دقیقه ، 5 B B
؛ 5-40 دقیقه ، 5-45٪ B؛ 40-50 دقیقه ، 100٪ B؛ 50-55 دقیقه ، 100٪ B؛ 55-68 دقیقه ، 100٪ C ، 68-70 دقیقه ، 100٪ C. DAD در 220 ، 254 و 330 نانومتر تنظیم شد و شرایط ELSD به شرح زیر است: فشار گاز نبولایزر 3.7 میله ، دمای لوله تبخیری 40 درجه سانتیگراد و 4 بدست آورید
2.4.2. نیمه آماده سازی HPLC
عصاره Q. pubescens به دست آمده با استفاده از H2O / EtOH 1/1 سپس تا خشک شدن تبخیر شد ، در متانول (50 میلی گرم در میلی لیتر) حل شد و HPLC نیمه آماده سازی بر روی یک ستون C18 انجام شد (Phenomenex، Le Pecq، Ile-de-France، فرانسه ؛ Luna® 5 میکرومتر ، شناسه 250 میلی متر × 10 میلی متر). شستشو با استفاده از شیب چند مرحله ای آب (A) و استونیتریل (B) انجام شد ، هر دو با 0.1٪ اسید فرمیک اسیدی شدند: 5-5 دقیقه ، 5 B B. 5-10 دقیقه ، 5-100 B B و 10-14 دقیقه ، 100 B B ، در شرایط زیر: حجم تزریق: 100 میکرولیتر ، و سرعت جریان: 4.0 میلی لیتر در دقیقه. تزریق های چندگانه انجام شد و زیر بخش های مربوطه مربوط به هم جمع شدند.
2.5. کروماتوگرافی گازی- طیف سنجی جرمی (GC-MS)
تجزیه و تحلیل GC-MS با استفاده از کروماتوگرافی گازی Agilent 6890 (Palo Alto، CA ، ایالات متحده) مجهز به یک آشکارساز انتخابی جرمی Agilent MSD5973N ، یک نمونه اتوماتیک چند منظوره (Combi-Pal ، CTC Analytics ، زوینگن ، سوئیس) در HP- انجام شد. 1 ستون مویرگی MS (100٪ پلی متیل پیلی سیسیلوکسان ؛ 0.2 میلی متر × 50 میلی متر ؛ ضخامت فیلم ، 0.33 میکرومتر). نمونه ها (1 میکرولیتر) در حالت بدون شکاف (دریچه تقسیم: 50 میلی لیتر / دقیقه - 30 ثانیه) تزریق و در دمای 250 درجه سانتیگراد تزریق شد. گاز حامل در حالت جریان ثابت با 1 میلی لیتر در دقیقه هلیوم بود. درجه حرارت اجاق گاز از 60 درجه سانتیگراد به 180 درجه سانتیگراد در 2 درجه سانتیگراد در دقیقه افزایش یافته ، سپس از 180 درجه سانتیگراد به 300 درجه سانتیگراد در 6 درجه سانتیگراد در دقیقه و به مدت 5 دقیقه در دمای 300 درجه سانتیگراد نگهداری می شود. اکتساب در حالت اسکن (35-500 در هرمتر) (واحد توده اتمی) / ثانیه انجام شد ؛ میزان اسکن: 3.15 اسکن بر ثانیه و طیفهای جرمی در 70 ولتولار تولید شد.
شناسايي هاي كامل مبتني بر مقايسه طيف هاي انبوه با ادبيات ، كتابخانه هاي تجاري NIST ، ويلي ، Indianapolis ، IN ، آمريكا) و كتابخانه هاي آزمايشگاهي MS بود كه از مواد خالص ساخته شده و بهمراه مقايسه شاخص نگهداري خطي GC (LRI) [29،30] . شاخص هاي نگهداري با مجموعه اي از آلكان هاي خطي C8-C24 كه به عنوان مرجع استفاده مي شوند ، تعيين شدند.
2.6. بایوسس
خرید محصولات آرایشی از فروشگاه رابوکالا
2.6.1. مواد
صفحات 96 چاه تصفیه نشده از ترمو نونک (Villebon-sur-Yvette ، Ile-de-France، France) خریداری شد ، در حالی که صفحات UV شفاف از کاستار ، سیگما-آلدریش (سنت کوئنتین فالوایر ، اوورگن-Rhône-) به دست آمد. آلپ ، فرانسه). از فیلمهای چسبنده (Greiner Bio-One، Courtaboeuf، Île-de-France، France) برای آب بندی صفحات 96 چاه در طی جوجه کشی استفاده شد. نمونه ها (عصاره ها ، کسری ها ، استانداردها و کنترل ها) با غلظت 3/433 میلی گرم در میلی لیتر در دی متیل سولفوکسید (DMSO) در لوله های 1.5 میلی لیتری اپپندورف تهیه شده ، مناسب برای استفاده از سیستم پیپتینگ خودکار epMotion® 5075 (Eppendorf ، Montesson، Île) -de-France، France).
عصاره هیدرو گلیسیرین شده Q. چوب چوب قلوی مروارید که به دلیل فعالیتهای محافظت شده در برابر پیری عکس ، رادیکالهای آزاد و عوامل محیطی مورد استفاده تجاری قرار گرفته است ، در کنار نمونه های ما برای انجام مقایسه مستقیم بین ترکیبات مبتنی بر بلوط مورد آزمایش قرار گرفت.
2.6.2. ابزار دقیق
از سیستم پیپتینگ خودکار Eppendorf epMotion® 5075 برای انجام سنجش سنج استفاده شد. یک میکروپلیت ریدر (Spectramax Plus 384 ، دستگاه های مولکولی ، Wokingham ، برکشایر ، انگلستان) برای اندازه گیری مقادیر جذب استفاده شد. داده ها با نرم افزار SoftMaxPro (دستگاه های مولکولی ، Wokingham ، Berkshire ، انگلستان) به دست آمد و از نرم افزار Prism (GraphPad Software ، La Jolla، CA ، USA) برای محاسبه درصد مهار استفاده شد. مگر در مواردی که بیان شود ، نتایج به صورت درصد مهار (I٪) به شرح زیر محاسبه می شوند:
I٪ = [(ODcontrol - ODsample) / ODcontrol] 100 ((با بیان OD برای چگالی نوری).
به طور مشابه ، تمام OD با اندازه گیری خالی مربوط به جذب نمونه قبل از افزودن بستر اصلاح شد.
2.6.3. سنجش تراشکاری رادیکال DPPH
فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره ها و کسرها بر اساس فعالیت مهار کننده رادیکال پایدار 1،1-دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل (DPPH) با توجه به روش زیر اندازه گیری شد که به طور گسترده ای برای بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های گیاهی مورد استفاده قرار گرفت [31،32 ]: 150 میکرولیتر از محلول بافر اتانول / استات 0.1 M pH = 5.4 (50/50) در هر چاه ، به همراه 7.5 میکرولیتر عصاره مورد بررسی قرار گرفت (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم بر میلی لیتر). Trolox (360.7.8 میکرومولار در DMSO) و یک عصاره تجاری Rosmarinus officinalis L. (3.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شد. DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. اولین مطالعه OD در 517 نانومتر (ODblank) انجام شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول DPPH (25/386 میکرومولار در اتانول) در هر چاه توزیع شد. این صفحه در تاریکی و در دمای اتاق (RT) آب بندی و انکوبه شد. پس از 30 دقیقه ، خواندن OD نهایی در 517 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار انجام شد.
2.6.4. Tyrosinase Assays
تیروزیناز یک اکسیداز حاوی مس است که تولید ملانین را کنترل می کند. این ماده عمدتاً در هیدروکسیلاسیون L-تیروزین به L-DOPA (L-3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین. فعالیت مونوفنولاز) و اکسیداسیون بیشتر آن به دوپوکینون (فعالیت دی فنولاز) نقش دارد. از آنجایی که این آنزیم نقش مهمی در ملانوژنز بازی می کند ، مهار کننده های تیروزیناز در توسعه عوامل سفید کننده پوست نگران کننده هستند [33]. سنجش ها به شرح زیر انجام شد: 150 میکرولیتر از محلول تیروزیناز قارچ تهیه شده با غلظت 171.66 U / ml در بافر فسفات (100 میلی متر pH = 6.8) در هر چاه توزیع شد (غلظت نهایی آنزیم در هر چاه: 100 U / میلی لیتر (سنجش فعالیت مونوفنولی) یا 50 U / میلی لیتر (سنجش فعالیت دیفنولی)) ، همراه با 7.5 میکرولیتر عصاره مورد بررسی (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم بر میلی لیتر). كوجیك اسید (3.333 میلی متر در DMSO) و عصاره تجاری Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. (4.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شد. DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. این صفحه به مدت 20 دقیقه در RT قرار گرفت و انکوبه شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول l-تیروزین (سنجش فعالیت مونوفنولی) یا L-DOPA (سنجش فعالیت دی فنولیک) 1 میلی متر در pH بافر فسفات = 6.8 (غلظت نهایی بستر در هر چاه: 388 میلی متر) در هر چاه توزیع شد. پس از 20 دقیقه انکوباسیون ، ارزیابی OD در 480 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار انجام شد.
2.6.5. سنجش لیپوکسیژناز
لیپوکسیژناز ، آنزیمی حاوی آهن است که باعث مهار اکسیداسیون اسیدهای چرب اشباع نشده در هیدروپراکسیدهای مربوطه می شود ، نقش مهمی در التهاب دارد [34]. سنجش ها به شرح زیر انجام می شود: 150 میکرولیتر از محلول لیپوکسیژناز سویا تهیه شده با غلظت 686.66 U / ml در بافر فسفات (50 میلی متر pH = 8) در هر چاه توزیع شد (غلظت نهایی آنزیم در هر چاه: 400 U / میلی لیتر ) ، همراه با 7.5 میکرولیتر از عصاره های مورد بررسی (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم بر میلی لیتر). هیدرات کوئرستین (1000 میکرومولار در DMSO) و عصاره تجاری Arnica montana L. (3.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شد. DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. بشقاب مهر و موم شده و به مدت 10 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. سپس 100 میکرولیتر محلول اسید لینولئیک تهیه شده در بافر فسفات pH = 8 در هر چاه توزیع شد. پس از جوجه کشی به مدت 2 دقیقه در تاریکی ، اولین مطالعه OD با سرعت 235 نانومتر انجام شد. پس از جوجه کشی بیشتر از 50 دقیقه ، خواندن OD نهایی در 235 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار انجام شد.
2.6.6. روش الاستاز
الاستاز یک پروتئین سرین است که ترجیحاً الاستین را هضم می کند ، پروتئین بسیار الاستیک است که به همراه کلاژن کار می کند تا شکل و استحکام خود را به پوست ببخشد [35]. سنجش ها به شرح زیر انجام شد: 150 میکرولیتر از محلول الاستاز لوزالمعده خوک تهیه شده در غلظت 0.171 U / ml در بافر تریس (50 میلی متر pH = 8) در هر چاه توزیع شد (غلظت نهایی آنزیم در هر چاه: 0.1 U / میلی لیتر) ، همراه با 7.5 میکرولیتر عصاره مورد بررسی قرار گرفت (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم بر میلی لیتر). هیدرات کوئرستین (8583.33 میکرومولار در DMSO) و یک عصاره تجاری از Rubus idaeus L. (3.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شد. DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. این صفحه به مدت 20 دقیقه در RT قرار گرفت و انکوبه شد. اولین بار خواندن OD در 410 نانومتر انجام شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 2.06 میلی مولار در بافر تریس (غلظت نهایی Suc-AAA-pNA در هر چاه: 0.8 میلی متر) در هر چاه توزیع شد. پس از 40 دقیقه انکوباسیون ، ارزیابی OD در 410 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار انجام شد.
خرید محصولات آرایشی از فروشگاه رابوکالا
2.6.7. سنجش هیالورونیداز
هیالورونیدازها خانواده ای از آنزیم ها هستند که اسید هیالورونیک را تخریب می کنند ، یک گلیکوزآمینوگلیکان با وزن زیاد مولکولی از ماتریکس خارج سلولی. این ماکرو مولکول با ارائه یک ظرفیت منحصر به فرد برای اتصال و نگه داشتن مولکول های آب ، به طور گسترده در بدن و خصوصاً در حاشیه الیاف کلاژن و الاستین توزیع می شود: بنابراین نقش عمده ای در پیری پوست دارد [36،37]. سنجش ها به شرح زیر انجام شد: 150 میکرولیتر از محلول هیالورونیداز تهیه شده با غلظت 3/13 U / میلی لیتر در بافر هیالورونیداز (pH 7) در هر چاه توزیع شد ، همراه با 7.5 میکرولیتر عصاره ارزیابی شده (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم در میلی لیتر). تانیک اسید (0.435 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) و عصاره تجاری Rubus idaeus L. (3.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شد ؛ DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. درجه حرارت 20 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه و اولین بار خواندن OD با 405 نانومتر انجام شد ، سپس 100 میکرولیتر از محلول اسید هیالورونیک تهیه شده با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر در بافر (pH 5.35) در هر چاه توزیع شد و پس از 30 دقیقه جوجه کشی در دمای 37 درجه سانتیگراد ، 50 میکرولیتر از CTAB (استیل تری متیل آمونیوم برمید) با غلظت 40 میلی لیتر در محلول NaOH (2 prepared) تهیه شده در هر چاه اضافه شد و خواندن OD در 405 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار (ODsample )
نتایج به صورت درصد مهار (I٪) به شرح زیر محاسبه می شوند:
I٪ = [ODsample / (ODblank - ODcontrol)] 100 پوند.
2.6.8. کلاژناز سنجش
مسئول مقاومت کششی پوست ، کلاژن یکی از واحدهای ساختاری ماتریکس خارج سلولی را تشکیل می دهد. کلاژنازها آنزیمی هستند که مولکول کلاژن را در ناحیه مارپیچ آن شکاف می دهند و بیشتر در تخریب اجزای ماتریکس خارج سلولی دخیل هستند ، بنابراین منجر به چین و چروک پوست می شوند [38]. سنجش ها به شرح زیر انجام شد: 150 میکرولیتر از محلول کلاژناز تهیه شده با غلظت 53 U / ml در باکتری تریسین (5.5 pH) در هر چاه توزیع شد ، همراه با 7.5 میکرولیتر عصاره مورد بررسی قرار گرفت (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم در میلی لیتر). تانیک اسید (1.72 میکرومولار در DMSO) و یک عصاره تجاری گلیسیریزه گلابرا L. (3.333 میلی گرم در میلی لیتر در DMSO) به عنوان شاهد مثبت استفاده شدند. DMSO به تنهایی منفی (ODcontrol) را تشکیل می دهد. این صفحه به مدت 15 دقیقه در RT قرار گرفت و انکوبه شد. اولین مطالعه OD با سرعت 345 نانومتر انجام شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول FALGPA (2-furanacryloyl-l-leucylglycyl-l-prolyl-l-alanine) تهیه شده با غلظت 5.15 میلی مولار در بافر تریسین در هر چاه توزیع شد. پس از 30 دقیقه انکوباسیون ، ارزیابی نهایی OD در 345 نانومتر برای ارزیابی درصد مهار (ODsample) انجام شد.
نتایج به صورت درصد مهار (I٪) به شرح زیر محاسبه می شوند:
I٪ = [ODsample / (ODblank - ODcontrol)] 100 پوند.
2.6.9. تجزیه و تحلیل کل پلی فنول
مقدار کل پلی فنولیک با استفاده از روش Folin-Ciocalteu در صفحات 96 چاه به شرح زیر محاسبه شد: 39 میکرولیتر از آب فراصوت در هر چاه توزیع شد ، همراه با 15 میکرولیتر عصاره مورد بررسی قرار گرفت (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم). / میلی لیتر) از DMSO به عنوان كنترل منفي استفاده شد. سپس ، 25 میکرولیتر از محلول آب فاضلاب / فراصوت معرف Folin-Ciocalteu (1/1) در هر چاه اضافه شد. پس از 6 دقیقه انکوباسیون تحت همزن ، 100 میکرولیتر از محلول کربنات سدیم (75 گرم در لیتر) در هر چاه توزیع شد. این صفحه سپس در تاریکی به مدت 90 دقیقه در RT و در انکوباتور قرار گرفت. خواندن OD با سرعت 765 نانومتر انجام شد: مقادیر در میلی گرم معادل اسید گالیک (GAE) در هر گرم عصاره بیان شده است. منحنی استاندارد با محلول های اسید گالیک (محدوده غلظت: 200 ، 100 ، 50 ، 25 و 12.5 میکروگرم بر میلی لیتر) تهیه شد.
2.6.10. تجزیه و تحلیل کل فلاونوئید
مقدار کل فلاونوئید در صفحات 96 چاه به شرح زیر محاسبه شد: 100 میکرولیتر از مخلوط آب فراصوت / DMSO (1/1) در هر چاه توزیع شد ، همراه با 15 میکرولیتر عصاره مورد بررسی قرار گرفت (غلظت نهایی در هر چاه: 100 میکروگرم در میلی لیتر). از DMSO به عنوان كنترل منفي استفاده شد. سپس ، 10 میکرولیتر محلول تری کلرید آلومینیوم (100 گرم در لیتر) در هر چاه به همراه 15 میکرولیتر استات پتاسیم (1 M) و 100 میکرولیتر از آب فراصوت اضافه شد. این صفحه سپس در تاریکی به مدت 40 دقیقه در RT و در انکوباتور قرار گرفت. خواندن OD در 415 نانومتر انجام شد: مقادیر در میلی گرم معادل کوئرستین (QE) در هر گرم عصاره بیان شده است. منحنی استاندارد با محلولهای هیدرات کوئرستین تهیه شد (غلظت غلظت: 250 ، 125 ، 75 ، 25 و 5 میکروگرم بر میلی لیتر).
2.7 تجزیه و تحلیل HPLC-ESI-MS
اثر انگشت کسری با استفاده از یک سیستم HPLC Acquity (واترز ، گویانکورت ، ایل د فرانسه ، فرانسه) بدست آمد. جداسازی در ستون Acquity UPLC Kinetex® C18 (Phenomenex ، Kinetex® 2.6 میکرومتر C18 100 Å ، 150 میلی متر 2.1 میلی متر از من) در 25 درجه سانتیگراد با سرعت جریان 0.6 میلی لیتر در دقیقه انجام شد. حجم تزریق 1 میکرولیتر بود. فاز متحرک شامل آب (حلال A) و استونیتریل (حلال B) هر دو با 0.05 acid اسید فرمیک (کلیه درجه کروماتوگرافی) اسیدی شده و در حالت شیب چند مرحله ای استفاده می شد. شیب به شرح زیر عمل شد: 0-1 دقیقه ، 5 B B؛ 1-9 دقیقه ، 5-40 B B؛ 9-15 دقیقه ، 40-100 B B ، 15-17 دقیقه ، 100 B B؛ مرحله نهایی ایزوکراتیک به مدت 2 دقیقه با دمای 5٪ B. مدیر نمونه در دمای 15 درجه سانتیگراد قرار گرفت. شرایط ESI (یونیزاسیون الکتروپری) در حالت مثبت به شرح زیر تنظیم می شود: دمای منبع 150 درجه سانتیگراد ، دمای desolvation 500 درجه سانتیگراد. ولتاژ مویرگی 3 KV و ولتاژ مخروطی 10 ولت. از نیتروژن به عنوان مخروط (10 لیتر در ساعت) و گاز سیل (1000 لیتر در ساعت) استفاده شد.
2.8 تغییر رنگ عصاره
تغییر رنگ عصاره با جذب مولکولهای مسئول رنگ آمیزی روی کربن فعال انجام شد. تغییر رنگ هر دو ماده جامد و مایع با 1٪ W / W کربن فعال به مدت 1 ساعت انجام شد. کربن فعال شده پودری سپس با حل و تصفیه به راحتی از بین می رود.
2.9 تولید مواد آرایشی و بهداشتی مایع و جامد
تکیه گاه های آرایشی جامد و مایع سازگار با فرمولاسیون آرایشی برای تولید ماده فعال مورد بررسی قرار گرفت.
مالتودکسترین ، یک پشتیبانی آرایشی جامد ، به طور مستقیم به عصاره خام (مالتودکسترین / عصاره خام 2/1 وزنی بر وزنه) اضافه شد. سپس مخلوط تا خشک شده خلاء می شود و پودر حاصل با استفاده از گندم و ملات یکدست می شود.
پروپیلن گلیکول به طور مستقیم در طول فرآیند استخراج استفاده می شود: حدود 1 گرم از مواد گیاهی خشک و خرد شده با تقریبا 10 گرم پروپیلن گلیکول در RT با استفاده از همزن مغناطیسی (250 دور در دقیقه) به مدت 4 ساعت یا 7 ساعت 30 استخراج شد. سپس بر روی کاغذ فیلتر 8-12 میکرومتر فیلتر شدند.
2.10 آزمایش پایداری
آزمایش پایداری انجام می شود تا اطمینان حاصل شود كه ماده تركیبی مطابق با استانداردهای كیفیت در نظر گرفته شده و همچنین كارایی و زیبایی شناسی هنگام ذخیره در شرایط خاص است. آزمایش پایداری شتاب به شرح زیر انجام شد: هر دو ماده روی مالتودکسترین و پروپیلن گلیکول در گلدانهای شیشه ای با دمای 42 درجه سانتیگراد نگهداری شدند و نظارت هفتگی آن نمونه ها انجام شد. ارزيابي ويژگي هاي زيبايي شناختي به صورت ذهني انجام شد (تغييرات واضح در رنگ و بو توسط اپراتور ثبت شد) و به صورت عيني (بخش 2.10.2) و تركيبات شيميايي هر دو ماده پس از جداسازي توسط HPLC-DAD-ELSD مورد بررسي قرار گرفت. پشتیبانی لوازم آرایشی توسط SPE (استخراج فاز جامد ، بخش 2.10.1).
2.10.1. استخراج فاز جامد
کارتریج های SPE (Phenomenex ، فاز معکوس پلیمری Strata-XL ، 500 میلی گرم در 6 میلی لیتر) در جلوی قفل ها قرار گرفتند و به یک منیفولد خلاء وصل شدند. صربنت با 10 میلی لیتر متانول (MeOH) شرط بندی شد و با 10 میلی لیتر آب تعادل یافت. با باز شدن قفل و بسته شدن خلاء ، کارتریج SPE با 100 میلی گرم O وارد می شود
ak2_M یا با 10 میلی لیتر Oak3D / H2O (1/3 ولت / ولت). فشار خلاء در 40 kPa تنظیم شده است. پس از افزودن نمونه ، ابتدا ستون با 10 میلی لیتر H2O و سپس با 10 میلی لیتر H2O / MeOH (10/1 ولت / ولت) و در آخر با 10 میلی لیتر MeOH / دی کلرومتان (1/1 ولت / ولت) شسته شد. نمونه دو بار با 5 میلی لیتر MeOH شسته شد (این شستشوی مرحله ای به یک شستشوی تک 10 میلی لیتری ترجیح داده شد زیرا باعث بهبود عملکرد SPE نهایی می شود).
2.10.2. ارزیابی رنگ
رنگ با استفاده از اسپکتروفتومتر Color i ™ 5 (X-Rite، Grand Rapids، MI، USA) که قبلاً با یک مرجع سفید کالیبره شده بود ، مورد بررسی قرار گرفت. مقداری از مواد تشکیل دهنده تغییر یافته یا غیر موجود در لوله های شیشه ای (ضخامت نمونه: 6 میلی متر) قرار داده شده است. نتایج مطابق با فضای رنگی سه بعدی CIE 1976 L * a * b * (یا سیستم مختصات CIELab ، CIE — Komisioner Internationale de l’clairage) بیان شده توسط کمیسیون بین المللی روشنایی بیان شده است [40]. سه مختصات (به عنوان میانگین اندازه گیری های سه گانه بیان شده است) به ترتیب سبک بودن رنگ (L *) ، ویژگی قرمز-سبز آن (a *) و ویژگی زرد-مقابل آبی آن (b *) و ΔE را نشان می دهند. * ab تفاوت رنگ بین دو نمونه را نشان می دهد (ΔE * ab هیچ واحدی نخواهد داشت). این اختلاف رنگ به عنوان فاصله اقلیدسی بین نقاط نمایانگر آن نمونه ها در فضا ، به شرح زیر محاسبه می شود:
ΔE * ab = [(ΔL *) 2 + (Δa *) 2 + (Δb *) 2] 1/2.
یک ΔE * ab بین 1.00 تا 2.50 بیانگر نقاطی است که در آن یک فرد متوسط به طور بصری متوجه تفاوت رنگ می شود. اگر ΔE * ab کمتر از 1.00 باشد ، تفاوت رنگ به سختی توسط یک ناظر انسانی قابل درک است [41،42].
3. نتایج
همانطور که قبلاً بیان شد ، یک سری از گیاهان مدیترانه ای بر اساس میزان دسترسی و اصالت آنها در مورد فعالیت ضد پیری در ابتدا بیش از 500 مورد برای این مطالعه انتخاب شدند. از این بررسی ، به نظر می رسد که عصاره خام برگ Q. pubescens بهترین فعالیت های ضد پیری بی سابقه را نشان می دهد. علاوه بر این ، سهولت در تهیه مواد اولیه در منطقه و پتانسیل جذاب بازاریابی حاصل از یک ماده آرایشی و بهداشتی حاصل از آن (می توان در مورد اشراف این بلوط ترافل ایفا کرد) باعث شده است تا انتخاب آن برای تحقیقات بیشتر فراهم شود.
3.1 عصاره خام Oak1
ابتدا استخراج برگهای Q. pubescens با H2O / EtOH 1/1 برای پوشاندن دامنه قطبیت بزرگتر ممکن انجام شد ، از این رو برای بازیابی حداکثر متابولیت ها. برگ Q. pubescens جمع آوری شده در دو مکان در شرایط مشابه استخراج شد و تأثیر منشاء مواد اولیه بر ترکیب شیمیایی عصاره حاصل مورد بررسی قرار گرفت. منشأ مختلف مواد گیاهی باعث بازده کمی استخراج (از 10٪ تا 16٪) می شود. با این حال ، هیچ تفاوت عمده ای در پروفایل های فیتوشیمیایی عصاره بلوط به دست آمده از برگ های جمع آوری شده در مکان های مختلف مشهود بود (داده ها نشان داده نشده است). برای راحتی ، عصاره Q. pubescens به دست آمده با استفاده از H2O / EtOH 1/1 در مقاله حاضر به عنوان Oak1 گفته خواهد شد.
اثر انگشت HPLC این عصاره وجود گروه بزرگی از پلی فنول ها را بین 14 تا 56 دقیقه در حال شستشو نشان داد (شکل 1).
3.1.1. در آزمایشگاههای زیستی
فعالیتهای زیستی Oak1 با استفاده از سنجشهای آزمایشگاهی آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت ، و با تجزی زیست محیطی ترکیبات آرایشی تجاری مورد استفاده برای فعالیتهای مربوطه مورد آزمایش (کنترل مثبت) و به فعالیتهای زیستی یک ماده بلوط تجاری مقایسه شد. همانطور که در شکل 2 ارائه شده است ، Oak1 فعالیتهای آنتی اکسیدانی و ضد هیالورونیداز امیدوارکننده و همچنین برخی از فعالیتهای ضد التهابی جالب را در مقایسه با مواد تجاری نشان می دهد.

شکل 2. اثرات زیستی Oak1 ، عصاره Q. pubescens با استفاده از H2O / EtOH 1/1 به دست آمده ، در مقایسه با زیستی مواد تشکیل دهنده مواد آرایشی تجاری مورد استفاده برای فعالیتهای مربوطه آزمایش شده (کنترل مثبت) و به فعالیتهای زیستی یک ماده بلوط تجاری.
3.1.2. طرح کسری 1
برای توصیف ترکیبات فعال مسئول بیولوژیکی اثبات شده ، عصاره Oak1 سپس بر روی ژل سیلیکا تکه تکه شد (جدول 1). کسری 3/3 گرم از Oak1 منجر به بازیابی پنج کسر مجزا شد: F1 (سیکلوهگزان) ، F2 (سیکلوهگزان / دی اتیل اتر 1/1) ، F3 (دی اتیل اتر) ، F4 (متانول) و F5 (متانول / آب 1 / 1) کسرهای حاصل Oak1_F2 تا Oak1_F5 برای فعالیتهای زیستی خود مورد بررسی قرار گرفتند. هیچ تحقیق دیگری در مورد Oak1_F1 صورت نگرفت ، زیرا حتی اگر این بخش از نظر فعالیت زیست محیطی جالب باشد ، تولید هرگونه ماده آرایشی حاصل از آن به دلیل عملکرد ضعیف استخراج ، از نظر تجاری مناسب نیست.
جدول 1. پارامترهای استخراج (گلبولهای سفید) و فعالیتهای زیستی (سلولهای خاکستری) کسری F1-F5 ناشی از کسری عصاره Oak1.

محلولهاي كسري در DMSO در غلظت 433/3 ميلي گرم در ميلي ليتر غلظت گرديد و فعاليت آنها به همان روشي كه عصاره نفت خام مورد ارزيابي قرار گرفت ، انجام شد. نتایج این سنجشهای زیستی در جدول 1 آورده شده است. هیچ فعالیت زیستی قابل توجهی برای Oak1_F2 مشاهده نشده و تحقیقات دیگری در این زمینه آغاز نشده است. برخی فعالیتهای جالب ضد الاستاز برای Oak1_F3 گزارش شده است. هر دو بخش Oak1_F4 و Oak1_F5 به عنوان آنتی اکسیدان های قوی و مهارکننده های مهم هیالورونیداز ، مشابه عصاره خام Oak1 شناخته شدند. این بخشها همچنین فعالیت ضد الاستاز را نشان می دهند.
عصاره خام Oak1 ، و همچنین کسری Oak1_F3 ، Oak1_F4 و Oak1_F5 ، بیشتر توسط GC-MS مورد بررسی قرار گرفت. ترکیبات مشخص شده در جدول 2 ذکر شده است. به غیر از دی هیدرواکتینیدولید ، 6،10،14-trimethyl-2-pentadecanone و dihydro-2.3-benzofuran ، که در آزمایشگاه در دسترس نیستند ، همه این ترکیبات به دلیل فعالیت زیستی خود مورد سنجش قرار گرفتند. فقط nonanal فعالیت ضد الاستاز جالب توجهی را نشان داد که می تواند به فعالیت ضد الاستاز مشهود برای Oak1_F3 مشهود باشد.
جدول 2. ترکیبات عمده شناسایی شده توسط GC-MS در عصاره خام Oak1 ، و همچنین در کسری Oak1_F3 ، Oak1_F4 و Oak1_F5.

مقدار کل اسید فنولیک و فلاونوئید Oak1_F3 ، Oak1_F4 و Oak1_F5 تعیین شد. نتایج به ترتیب ارائه شده در شکل 3 و شکل 4 ارتباط بین این محتوا و فعالیتهایی که قبلاً برای کسری مربوطه مشهود بود نشان می دهد.
شکل 3. محتوای فنلی کل عصاره H2O / EtOH (1/1) Oak1 و سه بخش Oak1_F3 ، Oak1_F4 و Oak1_F5 (GAE معادل اسید گالیک معادل است).
شکل 4. مقدار کل فلاونوئید عصاره H2O / EtOH (1/1) Oak1 و سه بخش Oak1_F3 ، Oak1_F4 و Oak1_F5 (QE مخفف کوئرستین معادل است).
عصاره خام Oak1 ، و همچنین کسری Oak1_F4 و Oak1_F5 ، که همه یک قدرت آنتی اکسیدانی قوی دارند ، به نظر می رسد که کاملاً غنی از ترکیبات پلی فنلی هستند. چنین ارتباطی بین ترکیب شیمیایی و فعالیت آنتی اکسیدانی قبلاً در ادبیات گزارش شده است. تجزیه و تحلیل HPLC-ESI-MS از بخش Oak1_F4 نشان می دهد که این ماده عمدتا از کاتچین تشکیل شده است ، یک فلاوانول که از قبل شناخته شده است به عنوان یک آنتی اکسیدان قدرتمند عمل می کند [53].
همچنین بین فعالیتهای ضد هیالورونیداز و محتوای فنولیک در موارد کسری Oak1_F4 و Oak1_F5 و همچنین بین فعالیت ضد الاستاز و محتوای فلاونوئید در موارد کسری Oak1_F3 و در میزان کمتر ، کسر Oak1_F4 ، همچنین روابط مثبت مشاهده شد. قبلاً در ادبیات بیان شده است [52،54].
3.1.3. طرح کسری 2
از نتایج قبلی (بخش 3.1.2) ، به نظر می رسد که مولکول های مسئول فعالیتهای زیستی مورد آزمایش در قطبی ترین کسریهای حاصل از طرح کسری Oak1 1 ، یعنی کسریهای بدست آمده با دی اتیل اتر ، MeOH و MeOH / H2O 1 متمرکز شده اند. / 1 برای به دست آوردن اطلاعات در مورد این متابولیتها ، عصاره Oak1 با غلظت 50 میلی گرم در میلی لیتر در MeOH تقریباً توسط HPLC نیمه آماده سازی همانطور که در بخش مواد و روش ها توضیح داده شده است برای تفکیک قطبی (Oak1_PF که بین 0-7 دقیقه شستشو می یابد ؛ عملکرد: 62٪ ) از ترکیبات قطبی کمتر (Oak1_LPF که بین 7 تا 14 دقیقه طول می کشد ؛ عملکرد: 38٪ ؛ شکل 5). چندین تزریق محقق شد و کسری های قطبی / قطبی کمتر پی در پی به ترتیب جمع شدند تا مواد کافی برای بازیابی مقدار کافی برای ارزیابی فعالیتهای زیستی خود به همان روش Oak1 جمع شوند.

شکل 5. کروماتوگرام نیمه آماده سازی HPLC به دست آمده در یک ستون Luna® C18 (250 میلی متر mm 10 میلی متر ؛ 5 میکرومتر) در 330 نانومتر و با ELSD ، ارائه دو بخش حاصل از کسری Oak1.
هیچ فعالیت زیست محیطی قابل توجهی برای Oak1_PF به دست آمده با آب اضافه شده با 5٪ استونیتریل مشاهده نشده است: این بخش از ترکیبات قطبی بیشتری است که آنهایی که در کسری قبلی Oak1_F3 تا Oak1_F5 استخراج شده اند تشکیل شده است. به نظر می رسد ترکیبات قطبی کمتر استخراج شده در Oak1_LPF به طور عمده مسئول فعالیت های گزارش شده برای Oak1 هستند: مقادیر زیادی از پلی فنول ها که بین 10 تا 50 دقیقه طول می کشد ، مشخصا بر اساس طیف UV آنها و در مقایسه با استانداردهای موجود در آزمایشگاه (شکل 6) ) در حقیقت ، Oak1_LPF فعالیتهای ضد التهابی و ضد هیالورونییداز مشابهی را ارائه می دهد و به نظر می رسد در مقایسه با Oak1 یک آنتی اکسیدان کمی کمتر قوی است (شکل 7). برخی از فعالیتهای ضد الاستاز جالب توجه برای Oak1_LPF گزارش شده است ، که اثر آنتاگونیستی بالقوه بین هر دو بخش را نشان می دهد ، قطبی که مانع فعالیت کمتر قطبی در برابر این آنزیم می شود.

شکل 6. کروماتوگرام HPLC به دست آمده در یک ستون Luna obtained C18 (150 میلی متر mm 4.6 میلی متر ؛ 5 میکرومتر) در 330 نانومتر و با ELSD ، خانواده های اصلی ترکیبات مشخص شده در بخش Oak1_LPF را نشان می دهد.

شکل 7. اثرات زیستی Oak1 ، عصاره Q. pubescens با استفاده از H2O / EtOH 1/1 به دست آمده ، در مقایسه با موارد Oak1_PF ، Oak1_LPF و مواد تشکیل دهنده آرایشی تجاری مورد استفاده برای فعالیتهای مربوطه آزمایش شده (کنترل مثبت).
از دو استراتژی کسری اتخاذ شده ، به نظر می رسد که ترکیبات مسئول فعالیتهای زیستی Oak1 از قطبیت میانی هستند. فرایند بعدی اتخاذ شده برای توسعه بیشتر مواد آرایشی بر پایه بلوط ، برای استخراج ترجیحی آن ترکیبات سازگار خواهد شد و از این رو ، فعالیتهای زیستی آنها را پتانسیل می دهد.
3.2 توسعه مواد آرایشی
پس از شناسایی بخش فعال ، ماده آرایشی طبیعی مربوطه می تواند توسعه یابد. الزامات لازم برای چنین پیشرفتی کاملاً بیشمار است ، همانطور که در شکل 8 نشان داده شده است: عصاره های طبیعی یا کسری که از حیات زیستی جالب توجه را نشان می دهد ، معمولاً به طور مستقیم در یک فرمولاسیون قرار نمی گیرند زیرا ممکن است خصوصیات نامطلوبی را نشان دهند (رنگ ، بو ، ویسکوزیته و غیره). افزودن یک پشتیبانی آرایشی مناسب ، چه مایع و چه جامد ، می تواند برای تسهیل ترکیب مواد طبیعی در یک فرمولاسیون آرایشی ضروری باشد.

شکل 8. استراتژی اتخاذ شده برای تهیه یک ماده آرایشی طبیعی ، از منابع گیاهی گرفته تا فرمولاسیون.
3.2.1. مواد آرایشی جامد
همانطور که قبلاً در بخش 3.1 بیان شد ، ترکیبات مسئول بیولوژیکی Oak1 از قطبیت میانی هستند ، بنابراین H2O / EtOH 1/1 مناسب ترین سیستم حلال برای توسعه بیشتر یک ماده آرایشی بر پایه بلوط نیست. با افزودن این مشاهدات ، می توان ادعا كرد كه از بین بردن آب از طریق غلظت با تبخیر خلاء بسیار مصرف كننده انرژی است ، و از این رو چنین سیستم حلال از این جهت مناسب ترین تولید صنعتی مواد اولیه نیست. برای تعیین محتوای متابولیت های فعال عنصر آینده و تسهیل مقیاس صنعتی فرآیند ساخت آن ، H2O / EtOH 1/1 توسط EtOH خالص جایگزین شد: برای راحتی ، عصاره Q. pubescens به دست آمده توسط 2 ساعت مکش برگ Q. pubescens در اتانول بعداً در مقاله حاضر به Oak2 گفته خواهد شد (محدوده عملکرد استخراج: 5-5٪). فعالیتهای زیستی Oak2 با استفاده از سنجشهای آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 9 ارائه شده است ، جدا از فعالیتهای آنتی اکسیدانی و ضد هیالورونییداز نوید بخش که قبلاً در عصاره H2O / EtOH 1/1 Oak1 مشهود است ، Oak2 نیز برخی از فعالیتهای ضد التهابی و به ویژه برخی از فعالیتهای بسیار جالب ضد الاستاز را نشان می دهد.

شکل 9. اثرات زیستی Oak2 ، عصاره Q. pubescens با استفاده از اتانول خالص به دست آمده ، در مقایسه با فعالیتهای زیستی عصاره جدا شده Oak2D ، عصاره تغییر رنگ رسوب شده در مالتودکسترین Oak2DM و مواد تشکیل دهنده آرایشی تجاری مورد استفاده برای فعالیتهای مربوطه مورد آزمایش (کنترل مثبت) .
حلال های آلی که برای استخراج مولکول های فعال از یک گیاه استفاده می شوند ، همچنین مولکول های مسئول رنگ گیاه را استخراج می کنند ، که به طور کلی در محصولات مراقبت از پوست غیرقابل قبول است [55] و بنابراین نیاز به ارسال بیشتر برای پردازش دارند ، از جمله مهمترین روش تغییر رنگ. تغییر رنگ می تواند با جذب مولکول نامطلوب روی کربن فعال انجام شود: کربن فعال شده پودری را می توان به راحتی به عصاره مایع اضافه کرد و سپس با حل و تصفیه از آن خارج شد. چندین شرایط تغییر رنگ با استفاده از طول مدت تغییر رنگ و انواع مختلف عصاره / نسبت کربن فعال مورد آزمایش قرار گرفت. بهترین نتیجه بدست آمد که تغییر رنگ Oak2 با 1٪ وزنی (W / W) کربن فعال به مدت 1 ساعت انجام شد. عصاره به طور مناسب تغییر یافته Oak2D (جدول 3: ΔE * ab> 2.5 ، که نشانگر تفاوت رنگ به راحتی قابل تشخیص برای چشم انسان است) پس از حذف کربن فعال شده (بازده بازده بازیابی: 55-60٪) و فعالیتهای زیستی آن مورد بررسی قرار گرفت. استفاده از سنجش آزمایشگاهی با توجه به نتایج ارائه شده در شکل 9 ، می توان نتیجه گرفت که تغییر رنگ در فعالیت های آنتی اکسیدانی و ضد هیالورونیداز عصاره تأثیر نمی گذارد ، اما برخی از خسارات ناشی از فعالیت های ضد التهابی و ضد الاستاز مشهود است.
جدول 3. تغییرات رنگ (با SD ، انحراف استاندارد) برای مواد آرایشی جامد و مایع پس از تغییر رنگ کربن فعال مشاهده می شود.

مالتودكسترین ، ماده جامد مورد استفاده در مواد آرایشی برای اتصال سایر ترکیبات و تثبیت فرمولها ، سپس به عصاره Oak2D (مالتودكسترین / عصاره خام 2/1 وزنی در وزنی) اضافه شد. سپس مخلوط تا خشک شده خلاء می شود و پودر حاصل (Oak2DM) با استفاده از گندم و ملات هموژن می شود. فعالیتهای زیستی Oak2DM ، و همچنین به تنهایی مالتودکسترین (هیچ فعالیتی گزارش نشده است ؛ داده ها نشان داده نشده است) ، با استفاده از سنجش آزمایشگاهی که قبلاً مشخص شده بود (در همان غلظت عصاره ها و کسری) ارزیابی شدند. با توجه به نتایج ارائه شده در شکل 9 ، می توان نتیجه گرفت که افزودن مالتودکسترین ، تأثیر معنی داری بر ضد هیالورونیداز ، آنتی اکسیدان و ضد التهاب عصاره ندارد ، اما یک کاهش چشمگیر فعالیت ضد الاستاز در مقایسه با عصاره خام Oak2 مشهود است.
ماده جامد Oak2DM توسعه یافته در اینجا به نظر می رسد یک ماده مؤثر است که در فرمول ضد پیری آرایشی ترکیب می شود. با این حال ، هنوز هم می توان برخی از بهینه سازی ها را در تولید این ماده بلوط جامد انجام داد. برخی از آزمایشات تغییر رنگ بیشتر باید انجام شود تا به چنین سطح تغییر رنگی یا حتی بهتری برسیم ، بدون چنین ضرر بزرگی. همچنین می توان تصور کرد که تنظیمات نسبت مالتودکسترین به عصاره حاوی رنگ بطور بالقوه ممکن است منجر به از بین رفتن کمبود فعالیت ضد الاستاز شود.
3.2.2. مواد آرایشی و بهداشتی مایع
مواد تشکیل دهنده مایع برای تهیه برخی از مواد آرایشی ترجیح داده می شوند. پروپیلن گلیکول یکی از پرکاربردترین مواد پشتیبانی کننده آرایشی است: به عنوان یک ماده مرطوب کننده ، یک ماده کاهش دهنده ویسکوزیته و به عنوان یک حلال عمل می کند ، بنابراین در بسیاری از فرمول های مراقبت شخصی از جمله پاک کننده های صورت ، مرطوب کننده ها و غیره به کار می رود. برای استخراج مستقیم متابولیتهای فعال برگهای Q. pubescens مورد آزمایش قرار گرفت: برگهای ماکارات در پروپیلن گلیکول (گیاه خشک شده / پروپیلن گلیکول 1/10 وزنی در هفته) به مدت 4 ساعت در دمای اتاق. برای راحتی ، عصاره بعدی Q. pubescens در مقاله حاضر به Oak3 نیز گفته خواهد شد.
تغییر رنگ بعدی Oak3 انجام شد. چندین تلاش با استفاده از نسبت های مختلف کربن Oak3 / فعال شده و زمان تغییر رنگ انجام شد. از بین این آزمایشات ، به نظر می رسد که مناسب ترین پارامترهای تغییر رنگ در علاوه بر این از 1 / (وزنی / وزنی) کربن فعال به مدت 1 ساعت است: عصاره تغییر رنگ بیشتر به عنوان Oak3D ، پس از حذف کربن فعال بازیابی شد. از اندازه گیری های رنگ ارائه شده در جدول 2 ، به نظر می رسد که ΔE * ab کمتر از 1.00 است ، که نشان دهنده تفاوت رنگ به سختی توسط یک ناظر انسانی قابل درک است. بنابراین ، می توان نتیجه گرفت که برای بدست آوردن عصاره مایع مناسب جدا ، باید تلاش های دیگری برای تغییر رنگ انجام داد.
اثرات زیستی Oak3 و Oak3D ، و همچنین مواردی از پروپیلن گلیکول به تنهایی (هیچ فعالیتی گزارش نشده است ؛ داده هایی که نشان داده نشده است) با استفاده از سنجش آزمایشگاهی مورد آزمایش قرار گرفتند (شکل 10): هیچ فعالیت زیستی جالبی اثبات نشد.

شکل 10. عصاره زیستی Oak3 و Oak 4 ، عصاره Q. pubescens به دست آمده با استفاده از پروپیلن گلیکول ، در مقایسه با زیستی عصاره تغییر یافته Oak3D و مواد تشکیل دهنده آرایشی تجاری مورد استفاده برای فعالیت های مربوطه تست شده (کنترل مثبت).
سپس یک تلاش دیگر با استفاده از زمان مکش بیشتر انجام شد: برگ بلوط ماکارات در پروپیلن گلیکول (گیاه خشک / پروپیلن گلیکول 1/10 وزنی بر وزنی) به مدت 7 ساعت 30 در دمای اتاق. عصاره Q. pubescens متعاقب آن ، که به Oak4 گفته می شود ، فعالیتهای امیدوارکننده ای ضد هیالورونیداز ، ضد التهابی و ضد اکسیدان را نشان می دهد (شکل 10). با این حال ، تغییر رنگ بیشتر Oak4 با استفاده از 0.1٪ (w / w) کربن فعال برای 2 ساعت 30 (تغییر رنگ کارآمد: ΔE * ab> 1 ؛ جدول 2) به طور چشمگیری بر کلیه زیستی که قبل از استفاده از کربن فعال مشهود است تأثیر می گذارد (نمایش Oak4D هیچ فعالیت در همه ؛ داده ها نشان داده نشده است).
از این نتایج ، کاملاً واضح به نظر می رسد که زمان ماسکراسیون بسیار تحت تأثیر فعالیتهای زیستی عصاره متعاقب آن است. با این وجود ، برخی از آزمایشات تغییر رنگ بیشتر باید انجام شود تا در حالی که فعالیت ضد پیری بسیار جالب Oak4 را حفظ می کنیم ، به تغییر رنگ مناسب برسیم. سرانجام ، گلیکولهای سبزتر نیز در حال حاضر مورد آزمایش قرار می گیرند تا یک ماده آرایشی طبیعی تر نیز تولید کنند.
3.2.3. تست های پایداری
آزمایش پایداری شتاب که انجام شده است در گلدانهای شیشه ای با دمای 42 درجه سانتیگراد انجام شد تا اطمینان حاصل شود که مواد تولید شده مطابق با استانداردهای کیفیت مورد نظر و همچنین عملکرد و زیبایی شناسی هنگام نگهداری در شرایط خاص است. از آنجایی که هیچ قانونی در مورد نحوه انجام این نوع آزمایش ها وجود ندارد ، شرایط آزمایش خاص توسط سازنده تعریف می شود. به طور معمول ، تصمیم گیری می شود که محصول پس از هشت هفته آزمایش پایدار باشد یا خیر ، و اجماع وجود دارد که می گوید اگر یک محصول پس از هشت هفته در دمای 45 درجه سانتیگراد پایدار باشد ، پس از یک سال ذخیره در یک اتاق با ثبات مطابقت دارد. درجه حرارت.
در مورد حاضر ، نظارت دوره ای از آن نمونه ها در حال حاضر انجام شده است: ارزیابی بصری / بویایی از ویژگی های مهم زیبایی شناختی مانند رنگ ، رایحه ، بافت انجام می شود و ترکیبات شیمیایی هر دو ماده در هفته بررسی می شود. تکامل ترکیب مولکولی این ترکیبات نهایی و بویژه محتوای فنلی آنها ، توسط HPLC در همان شرایط آزمایشگاهی دنبال می شود (بخش 2.4.1). آزمایشات به پایان نرسیده است ، اما تاکنون ، یعنی یک ماه پس از شروع آزمایش پایداری ، هیچ تغییری در ترکیب ماده مورد نظر مشاهده نشده است ، اما بررسی های بیشتر باید این مشاهدات را تأیید کند.
علاوه بر این ، لازم است که پس از تعیین فرمول مشخص ، این آزمایشات پایداری را به جلو بکشید: آزمایش های اضافی باید در یک اتاق پیری انجام شود که در آن اثر تغییرات دما / روشنایی تقلید کننده محصولاتی که محصول نهایی به آنها ارائه می شود ، از فرمول بندی تا مصرف مصرف کننده قابل کنترل است.
3.3 فرمول بندی
نمونه ای از یک فرمول ضد پیری که یک ماده طبیعی آرایشی را تشکیل می دهد ، که بر اساس برگ بلوط ترافل ساخته شده است ، در جدول 4 آورده شده است. این ماده به اندازه کافی تیتراژ می شود که حتی در صورت استفاده در مقدار کم در یک فرمول نیز کارآمد باشد: بسته به فعالیت آرزو می کنیم ، بلوط فعال ، جامد یا مایع ، در مقادیر مختلف از 0.10٪ تا 1.00٪ در فرمول گنجانیده شود ، و در نتیجه مقدار فاز آبی برای احترام به نسبت فرمول تنظیم می شود.
جدول 4. نمونه ای از فرمول ضد پیری با استفاده از ماده Q. pubescens.

4. نتیجه گیری
در این مقاله ، فرایند R&D اتخاذ شده برای ایجاد یک ماده آرایشی جدید عینک شده ، از منابع آبیاری گیاه گرفته تا فرمولاسیون مواد تشکیل دهنده واقعی ، با استفاده از نمونه تولید وعده دهنده مواد ضد پیری طبیعی امیدوار کننده بر اساس عصاره برگ Q. pubescens ، به تفصیل ارائه شده است.
استفاده از فن آوری های غربالگری توان بالا در نمونه های محصول طبیعی کشف و توسعه و استفاده از مواد آرایشی طبیعی را تسریع می بخشد ، اما چنین غربالگری هنوز یک کار طولانی مدت است [56]. اخیراً گفته شد كه از هر 100 منبع ژنتیكی كه به عنوان بالقوه مورد علاقه شناخته می شوند ، پنج مورد در فرمول های مراقبت های زیبایی و مراقبت شخصی به پایان خواهند رسید [57]. در حقیقت ، پس از تولید این ماده ، باید تمام آزمایشات مربوط به اثربخشی ، کیفیت ، ماندگاری و ایمنی و تحمل پذیری (سمیت سمیت ، تحریک پذیری پوست و چشمی) را دقیقاً در سراسر زنجیره توسعه قبل از شروع بازار عرضه کند. تنها پس از این مجموعه کنترل ، یک فرمول ساز در استفاده از این ماده در فرمول نهایی محصول نهایی در نظر گرفته خواهد شد. برخی محققان در واقع ارزیابی سم شناسی را مستقیماً در فرایند تحقیق و توسعه ماده آرایشی ادغام می کنند تا از کشف ناخوشایند در پایان فرآیند جلوگیری کنند ، که می تواند منجر به محدودیت یا حتی ترک استفاده از این ماده به دلیل نگرانی در مورد سمیت شود [58]. هوشیاری در مورد پیروی از مقررات در سراسر جهان توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) تضمین شده است. در سطح اروپا ، کمیته علمی ایمنی مصرف کننده (SCCS ، جایگزین SCCNFP سابق) یادداشتهای راهنما را که حاوی اطلاعات مربوط به جنبه های مختلف آزمایش و ارزیابی ایمنی مواد آرایشی است ، تأسیس و تجدید منظم می کند [59]. این یادداشت ها باید بسته به ، به عنوان مثال ، به ماهیت مواد تشکیل دهنده وارد فرمولاسیون ، بر روی فرمولاسیون محصول نهایی خود ، و دفعات و مسیر استفاده مصرف کنندگان از محصول ، در هر مورد خاص تنظیم شود.
از این رو ، چنین ترجمه ای از تحقیقات آزمایشگاهی برای موفقیت های تجاری اغلب به زمان (تا چند سال) زمان نیاز دارد و تولید کنندگان باید سال ها پیش از اسب های مناسب در مورد روند بازار حمایت کنند.
دستیابی به نگاه طبیعی اکنون مهمترین هدف دختران است. اما ظاهر آرایش "بدون آرایش" چیست؟ همه چیز در مورد چگونگی استفاده از حداقل آرایش است. اما در عین حال بسیار زیبا و تازه به نظر برسید. این کمک می کند که محصولات خود را از تهیه کننده محصولات زیبایی ارگانیک دریافت کنید. امروز می خواهیم نکاتی را در مورد چگونگی دستیابی به این ظاهر به شما ارائه دهیم. ادامه مطلب |  |